?

Log in

No account? Create an account

Previous Entry | Next Entry

May. 20th, 2011

В лабе второй раз случается то, что я называю "кошмар молекулярного биолога" . Белок выделяется, кристаллизуется, определяется его структура и выясняется, что это не тот белок, что нужно... Корень зла - хранение глицерольных стоков микробов, а не ДНК.

Что-то в этом роде мне иногда является в кошмарах. :)

Tags:


Comments

( 15 comments — Leave a comment )
u_niq
May. 21st, 2011 06:33 am (UTC)
А из-за чего это произошло? Кто-то перепутал клетки/плазмиду при замузеивании?
overscience_mes
May. 21st, 2011 05:28 pm (UTC)
никто не узнает, конечно... Скорее виноват Стратагеновский кит, иногда, редко, мутантная плазмида представляет собой смесь мутантной и нет по вполне объективным причинам. Сиквенс люди нынче читают буковками и на графики не смотрят, если ни что не внушает подозрений и два пика могут не увидеть. После, плазмиду трансформируют для экспрессии и берут, скажем, одну колонию. А этот мужик еще и колонии отдельно тестировал для лучшей продукции - естественно дикий тип продуцировался не хуже. Из этого добра делают глицерольный сток.
u_niq
May. 21st, 2011 06:01 pm (UTC)
Понятно. Олька в свое время для избавления от катенанов, которые к тому и приводят, била лигазную смесь топоизомеразой что-ли
overscience_mes
May. 21st, 2011 06:02 pm (UTC)
ну, это избыточно чаще всего... это уже перфекционизм :)
u_niq
May. 21st, 2011 06:05 pm (UTC)
Неа, у нее реально с этим была проблема. Там нужно было вставить определенный кусок из плазмиды. И потом анализировать после пропускания плазмиды через эуки, выделения из них и при перетрансформации соотношение этой плазмиды и рекомбинантной (эуки этот кусок должны были выкинуть обратно). И она видела смеси и без эукариотов. Избавилась ровно при такой обработке
overscience_mes
May. 21st, 2011 06:07 pm (UTC)
о, да - это особый случай, надо запомнить
seadevil001
May. 21st, 2011 09:24 am (UTC)
А массспек сделать, самый простой, перед кристаллизацией - религия не позволила?
overscience_mes
May. 21st, 2011 05:31 pm (UTC)
у нас на департаменте нет ни одного массспека, на университетский идти - очередь. Кристаллизацию делают по свежему, сразу после колонки, в тот же день. Кстати, темна я в этом вопросе, точечную мутацию на 55 кДа - так хорошо видно нынче? В 2001 году мне говорили, что фосфат не разглядишь.
seadevil001
May. 21st, 2011 07:12 pm (UTC)
Зависит от аппарата конечно, но в принципе - method of choice for mAb production QC. То есть гликозилирование и первичная структура подверждаются однозначно.
anatol_olegych
May. 21st, 2011 11:16 am (UTC)
как говаривал мой знакомый, полгода в лаборатории помогут вам сэкономить два дня в библиотеке...

массспек, да.
или еще пцр на плазмиду из бактерии и отсеквенировать за 5 долларов

кошмар это когда первый раз произошло. Второй раз шейм он ... известно кого.
overscience_mes
May. 21st, 2011 05:38 pm (UTC)
не знаю, чей шейм - люди разные, организация хранения штаммов и плазмид - запущена, но это личное дело каждого, начальство к этому отношения не имеет
а кошмар - мой личный, я когда делаю такого рода работу - боюсь и перестраховываюсь, а они, кристаллографы и чистые биохимики, используют методы молбиологии как черный ящик, они меньше боятся :)
anatol_olegych
May. 22nd, 2011 02:05 am (UTC)
Я человек дикий, по моим представлениям, кристаллизовать и структуру определисть // это же какие.то многие недели, если не месяцы, нет?

Как говорят в инструкции к любому киту по трансформации: не забывайте делать контроли. Они часто не нужны, а нужны только тогда, когда что.то не сработало...
vigna
May. 21st, 2011 03:57 pm (UTC)
Я слышала про какие-то подобные кошмары, когда нужный белок ВНЕЗАПНО оказывался не нужным белком, а кератином.
А что не так с хранением глицерольных стоков?
overscience_mes
May. 21st, 2011 05:40 pm (UTC)
нет, это тот белок, но он без нужной мутации из-за которой это все затевалось. А про стоки - я выше рассказала Саше.
anast4509824
May. 21st, 2011 05:34 pm (UTC)
cool:)
Вы не представляете как мне это понравилось! Спасибо вам за то что вы есть
( 15 comments — Leave a comment )

Latest Month

October 2017
S M T W T F S
1234567
891011121314
15161718192021
22232425262728
293031    
Powered by LiveJournal.com
Designed by Ideacodes